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DNA合成服务
  DNA的合成有磷酸三酯法、亚磷酰胺法、氢磷酸法等,现在常用的是固相亚磷酰胺法,它具有快速、方便、偶联效率高等特点。一般从3′向5′合成,通过下列四个步骤加上一个核苷酸。   
  
  第一步:脱保护:用三氯乙酸或二氯乙酸脱去连在固相载体上的核苷酸5′羟基上的保护基团DMT,使它暴露出来进行下一步反应。   
  
  第二步:偶联:将亚磷酰胺单体用四唑活化,形成高反应性的亚磷酰四唑,进入合成柱,与连在固相载体上的寡核苷酸5′羟基偶联,这一步效率一般在98%以上。   
  
  第三步:封闭:为了防止少量未反应(<2%﹞的连在固相载体上的5′羟基进入下一循环,用醋酐对其进行乙酰化封闭,大大提高了最后产品的纯度。   
  
  第四步:氧化:缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接,而亚磷酯键不稳定,易被酸、碱水解,此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酯转化为磷酸三酯,得到稳定的寡核苷酸。   
  
  经过上面四个步骤,核苷酸被逐个加到合成的寡核苷酸链上。最后用浓氨水把寡核苷酸从固相载体上切割下来,脱去碱基和磷酸基团上的保护基团,随后进行纯化和定量。 纯化方法:寡核苷酸的纯化常用的方法有OPC,HPLC,PAGE,C18等方法。OPC柱中装有对DMT具有亲和力的树脂,合成DNA片段时保留5'端最后一个碱基上的DMT,所有合成产物吸附在OPC柱上以后,用稀的有机溶剂洗柱,带有DMT的片段吸附能力强,不易被洗脱,不带有DMT的片段吸附能力弱,被洗脱。然后用三氟乙酸TFA或三氯乙酸TCA脱去DMT基团,再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。这种方法的优点是快速,简易。但是其专一性吸附DMT能力有限,不免仍然有短片段带入的可能,而且负载量小。特别是对长于25碱基以上的片段纯化效果不好。利用离子交换或反相HPLC纯化寡核苷酸是国外公司常用的方法,它具有自动化程度高、快速、简便的优点,缺点是需要仪器,对长片段效果不理想。PAGE纯化是利用长短片段带的电荷不同,电泳迁移率不同来分离不纯物和产品,它的优点是产品纯度高、质量可靠,是国内许多公司推崇的方法,缺点是实验步骤多,费人工。本公司利用PAGE纯化产品,然后用C18脱盐,也可按照用户的要求对修饰的寡核苷酸进行HPLC纯化。 寡核苷酸的定量:Oligo DNA是以OD260值来计量的。在1cm光程标准石英比色皿中,260nm波长下吸光度为1的1毫升Oligo溶液定义为1 OD260。虽然对于每种特定的寡核苷酸来说,其碱基的组成不尽相同,但1 OD260 Oligo DNA的重量约为33 μg,每个碱基的平均分子量约为330 Da。因此合成的Oligo DNA摩尔数可按以下公式近似计算: 摩尔数(μmol)=[OD值×33]/[碱基数×330] 溶解和保存寡核苷酸:本中心提供的是真空干燥的DNA,呈干膜状或粉末状在离心管底部,可以-20℃或室温长期保存。开启瓶盖时小心不要丢失,请先稍微离心,再加入足量的水充分振荡溶解。溶解DNA的水最好无菌,pH大于7.0。要溶解成所需浓度的寡核苷酸,可按下式计算加入ddH2O的量: 所需水的量(ml)= [OD值×33]/[(碱基数×330) ×所需浓度(μM)]溶解好的DNA最好保存在-20℃,带有荧光标记的引物请注意避光保存